Indsamling og konservering af giftige havslanger

Projektets baggrund: Havslanger er de mest udbredte og talrigeste af verdens giftige krybdyr. Havslanger forekommer i tropiske og subtropiske vandområder i det Indiske Ocean og Stillehavet. De fleste arter er koncentreret i Sydøstasien og den australske region. Havslanger forekommer med stor variation i antal og artssammensætning på lavt vand langs kysterne, i floder og flodmundinger og omkring øer (Rasmussen et al. 2001). På et højere taxonomisk niveau er havslanger nærmest beslægtet med terrestriske giftsnoge (elapider), som omfatter nogle af de mest giftige slanger i verden (de australske giftslanger, kobraer, mambaer, kraiter og koralslanger). Havslanger, eller de vandlevende giftsnoge, og terrestriske giftsnoge kaldes tilsammen proteroglyfe slanger på grund af gifttændernes placering forrest på overkæben. På nuværende tidspunkt er der beskrevet over 60 arter af havslanger (Rasmussen, 1997, 2002; David & Ineich, 1999).

Følgende 3 delprojekter kan gennemføres med Galathea 3's nuværende sejlplan:

Vikarians og ubeskrevne arter: Grundlæggende mangler vi mere viden om havslangers systematik og økologi. Gruppens store udbredelse samt særdeles komplicerede systematik har gjort det vanskeligt at få overblik over de mange artskomplekser, som præger billedet. Vi mangler især at få indsamlet i de områder, som forbinder Asien med den australske region. Når man undersøger flere arter, som er udbredt i begge regioner, viser individerne fra hvert område en klar forskel både morfologisk og molekylært. På nuværende tidspunkt betragtes dette fænomen som et vikariansmønster hos nogle forskere (Rasmussen & Iniche, 2000: Rasmussen et al. submitted), hvorimod andre betragter det som geografisk variation inden for vidt udbredte arter (Cogger et al., 1983). For at kunne løse dette problem er det vigtigt at indsamle individer i de områder, hvor forskellen mellem to to regioner tilsyneladende forekommer. Hos havslanger indikerer alle undersøgelser, at både den morfologiske og den molekylære forskel er koncentreret til området syd for Sulawesi (Java Hav, Banda Hav og vestlige Arafura Hav). På nuværende tidspunkt eksisterer der ikke betydelige samlinger fra dette område, og der findes ingen molekylære prøver. Området gemmer tilsyneladende også på ubeskrevne arter, idet jeg selv har fundet et enkelt individ fra Java Hav, som efter min bedste overbevisning er ny for videnskaben (man bør efter min mening have to eller flere individer, før man beskrevet en ny art). Desuden findes en artikel af Hattori et. al, (1974), som viser et foto af endnu en ubeskrevet art fra området. De indsamlede havslanger, som indgår i Hattori et al's. artikel blev desværre kasseret efter brug. Ved at indsamle havslanger fra dette område, vil vi kunne få flere ubeskrevne arter frem i lyset samt få et større overblik over hele artssammensætningen inden for havslanger (se også Rasmussen, 1997 p. 21). Mange indsamlinger af havslanger er foretaget af lokale fiskere, som hjemtager havslangerne som bifangst. Indsamlingsmetoden er udmærket, men man får desværre ikke den sammen mængde økologiske data, som man får ved at indsamle havslangerne selv. Ved at benytte Galathea 3 vil vi kunne få økologiske data med, som er så vigtig for at kunne forstå havslangernes biologi. Foruden diskussionen omkring arter har der også været rejst tvivl om typelokaliteten for enkelte typeeksemplar (lokalitet angivet som Sulawesi). Nogle forskere mener, at disse lokaliteter ikke kan være rigtige (Cogger et al. 1983; Goray et al., 1993), idet man ikke siden har fundet individer af disse arter i området (arterne er kun fundet nord for Australien). Indsamlingen af individer af disse arter fra de før omtalte områder vil kunne lukke enhver diskussion om typelokaliteternes rigtighed.

Ved at indsamle havslanger fra området mellem de to regioner vil vi få data, som umiddelbart kan anvendes i følgende tre artikler, der alle er under forberedelse:

Rasmussen, A.R. & Omby, M (in prep.) Sea snake types from Indonesia with additional data fra Banda Sea.

Ineich, I & Rasmussen, A.R. (in prep.) Hydrophis ornatus ocellatus - complex from Asia and Australia.

Rasmussen, A.R., Couper, P., Gravlund, P & Amey, A, (in prep.) A revision og Hydrophis pacificus - complex using morphology and dna data.

(Dr. Ivan Ineich er ansat på Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris og Dr. Patrick Couper og Dr. Andrew Amey er ansat på Queensland Museum, Australien.)





Giften fra havslanger er meget stærk. Undersøgelser ved hjælp af måleenheden "LD50" viser, at havslanger har den stærkeste gift pr. enhed fundet hos slanger (Barme, 1963; Pickwell, 1972; Tamiya, 1975; Mackessy & Tu, 1993). Havslangebid er derfor en af mange dødsårsager i Asien. På nuværende tidspunkt bliver omkring 4 millioner mennesker bidt af slanger i Asien hvert år, hvoraf 100.000 dør (Chippaux, 1998: World Health Organization, dette tal betragtes som et underestimat). I dag ved vi ikke, hvor mange af disse dødsfald, der skyldes havslangebid, men vi ved, at der forekommer dødsfald i alle asiatiske land pga. havslangebid (Reid, 1979; Warrell, 1994; Asanuma et al.,1998; pers.obs.).



Slangeforskning i Danmark: Danmark har en lang tradition i at forske i slanger, som går helt tilbage til Reinhardt og Lütken (sidstnævnte beskrev en havslange i 1862). Inden for de sidste 70 år har Danmark haft to velrenommerede slangeforskere: Dr. Helge Volsøe (disputerede i Vipera berus) og Dr. Jens Bødtker Rasmussen (disputerede i afrikanske slanger). Volsøe har blandt andet skrevet en del artikler om havslanger, hvor især hans artikel fra den Persiske Bugt bør fremhæves (Volsøe, 1939). Jeg har selv været så heldig at blive oplært af Dr. Jens Bødtker Rasmussen, som frem til sin alt for tidlige død (maj 2005) var verdens førende systematiker i afrikanske slanger. Desuden har Dr. Torben Wolff skrevet flere værdifulde artikler om havslanger i forbindelse med Galathea 2, Noona-Dan ekspeditionen og den 5. dansk-thai ekspedition. Danmarks store samling af havslanger, som blev grundlagt allerede ved den første Galathea ekspedition, blev siden udbygget under Dana-ekspeditionen 2, Galathea 2, Noona-Dan ekspeditionen og 5. dansk-thai ekspedition. Denne samling dannede grundlag for mine egne havslangestudier, og i dag har Zoologisk Museum, Københavns Universitet en af de bedste samlinger af havslanger i verden. De ovennævnte ekspeditioner indsamlede i alt 20 forskellige arter af havslanger, og med de sidste 15 års indsamlinger har museet individer fra ca. 40 havslangearter. Indsamlinger fra de foreslåede områder vil bringe Zoologisk Museums havslangesamling op i en klasse for sig selv og derved kunne tiltrække slangeforskere fra hele verden til gavn for danske forskere og studerende.

Enhydrina Schistosa - komplekset undersøgt ved hjælp af dna og morfologi: Enhydrina schistosa er en forholdsvis stor havslange, som kan blive op til 1,5 m lang og tykkere end en mands underarm. Arten er udbredt fra Den Arabiske Bugt i vest til Den Australske Region i øst, og dens store udbredelse over to verdenshave overgås kun Pelamis platurus og Hydrophis ornatus (Rasmussen, 1989; David & Ineich, 1998). Enhydrina schistora forekommer i floder og flodmundinger samt langs mudrede/blødbundede kyster og er lokalt meget talrig (Voris et al., 1983, pers.obs.). Giften regnes for at være ca. 10 gange stærkere end kobragift, og mængden af gift i giftkirtlen er ca. den samme som i en kobras kirtel (Smith, 1926; Reid, 1975; Mackessy & Tu, 1993; Warrell, 1994). Alle resultater peger på, at Enhydrina schistosa er involveret i langt de fleste bid og forårsager flest dødsfald inden for havslangebid (Duson (ed.), 1975; Gopalakrishanakone (ed.), 1994). Risikogruppen er mænd fra 20 år og opefter, som håndterer posenet, sorterer fisk om bord på en trawler eller bruger et træknet i floder eller flodmundinger. Risikogruppen tilhører typisk de fattigste fiskersamfund i Asien (Reid, 1975; 1979).

Forsøg udført med henholdsvis monovalent og polyvalent serum mod slangebid viser, at kun monovalent serum neutraliserer giften 100%. Det vil derfor være af afgørende betydning, at der kun er én art involveret i fremstilling af serum. Samtidig har det vist sig, at arter, som er vidt udbredt, kan have lokal variation i giftsammensætningen, således at det er nødvendigt at fremstille serum baseret på lokale individer for at få giften effektivt neutraliseret i de pågældende områder. I dag kender vi ikke Enhydrina schistosas populationssammensætning og artsstatus i hele dens udbredelsesområde, og vi kan derfor ikke vælge individer til serumfremstilling fra alle de "rigtige" lokaliter, således at vi får den bedst mulige dækning ud af den fremstillede serum. Derfor er det nødvendigt at undersøge den genetiske bestandsstruktur hos Enhydrina schistosa fra forskellige lokaliteter for derigennem at finde og afgrænse de eksisterende geografiske polulationer og arter. Resultatet kan derefter bruges i planlægningen af serumfremstilling. Foreløbrige dna-resultater (støttet af RUF-Danida fra 2000-2002) viser en større molekylær afstand mellem de asiatiske og australske individer af Enhydrina schistosa end mellem andre arter i Australien. Dette indikerer, at Enhydrina schistosa ikke er monofyletisk. Modsat viser morfologien, at begge områders individer repræsenterer en fælles monofyletisk gruppe, som er morfologisk klart velafgrænset fra andre arter af havslanger. Gruppen har en række fælles afledte karakterer (autapomorfier), som ikke findes hos andre havslanger, som eksempel kan nævnes kløft i hagen med et stærkt forlænget hageskæl, udad bukket overmellemkæbe (palatina), stærkt udviklet knoglekam (carina) på basis sphenoid, ingen bugskæl (ventraler) på forreste del af kroppen samt det samme antal tænder på overkæben (maxilla), desuden passer de fleste ydre skælkarakter sammen, dog med lidt geografisk variation (Rasmussen, 1997; Rasmussen et al., 2001; pers.obs.).

På nuværende tidspunkt mangler vi friske indsamlinger fra Den Arabiske Bugt, Pakistan, Vest-Indien, Burma samt i området omkring Indonesien (Java Hav, Banda Hav og Arafura Hav). Alle disse lokaliteter vil være af stor værdi for havslangeforskningen, men specielt indsamlinger fra Indonesien vil være af stor interesse for at få opklaret forbindelsen mellem de asiatiske og australske populationer.

Giftsnogenes opståen og udbredelse: Indtil for ganske nylig var de fleste slangeforskere enige om, at giftsnogene, inkl. havslanger, først blev udviklet for omkring 35 mio. år siden og derfor ikke kunne være af Gondwanaland-oprindelse. Men hvis man tager min slægtskabsanalyse (Rasmussen, 2002) med i sine overvejelser, må man sætte et stort spørgsmålstegn ved den meget unge alder, der er foreslået for udviklingen af giftsnogene. Min teori er støttet af palæontologiske fund af knoglerester: I 1999 blev et fund fra Wadi Abu Hashim i Nord Afrika beskrevet. Det er blevet dateret til midt i kridtperioden (for ca. 95 mio. år siden), og det indeholdt bl.a. ryghvirvler, som er blevet bestemt til at stamme fra meget avancerede slanger. Dette fund antyder, at alle de nulevende, store linjer inden for slanger var udviklet for 95 mio. år siden, og at giftsnogene altså havde deres selvstændige linje allerede på dette tidspunkt. Hvis man bruger knoglefundet til at stadfæste en mindstealder for giftsnogene, må man antage, at langt de fleste giftsnogelinjer allerede var udviklet, da Gondwanaland blev opsplittet.

Min teori er baseret på en analyse af morfologiske karakterer hos forskellige giftsnoge. Herved kan man konstatere, hvem af dem der deler avancerede, anatomiske træk, som de har arvet fra en fælles stamform. En alternativ forklaring på slægtskab og udbredelsesmønster kunne være, at forfaderen ikke levede på land, men i vand, og at spredningen til fx. den australske region er foregået ved, at stamformen er kommet svømmende fra et af de andre kontinenter, en på mange måde tillokkende hypotese, som vil placere havslanger centralt inden for giftsnoge (de fleste forskere betragter havslanger og de australske landgiftsnoge, som et sideskud til andre giftsnoge). At giftsnogene opstod før Gondwanaland blev splittet op og derefter passivt blev ført med, da landmasserne gled fra hinanden, er efter min bedste overbevisning dog den enkleste forklaring på nuværende tidspunkt. For at teorien kan testes, mangler vi indsamlinger fra det indonesiske område, hvor vi blandt andet i mangrover langs kysterne kan finde arter som Hydrelaps darwiniensis, Parahydrophis mertoni og Ephalophis graye (alle tre arter er kendt fra mangroveområder på sydvest siden af New Guinea, og findes formodentlig også omkring Banda Havets mangrovekyster). Disse tre arter repræsenterer efter min mening noget af det mest oprindelige inden for giftsnoge og vil sammen med allerede indsamlede giftsnogemateriale kunne danne basis for en mere detaljeret molekylær og morfologisk analyse af giftsnogenes slægtskab.



Materiale og metode: Til dna-analyse af havslanger bruges 4 forskellige gener i mitokondriet, som ved hjælp af PCR-teknik sekvenseres for at give information om nukleinsyresekvensernes rækkefølge. Mitokondriet udmærker sig ved at være forholdsvist nemt at sekvensere, velfungerende primers er tilgængelig. Mitokondriet er med held brugt i andre DNA-analyser, som involverer slanger (Keogh, 1998; Rasmussen et al., submitted). På nuværende tidspunkt er der allerede sekvenserede prøver fra Bharain, Bangladesh, Thailand, Vietnam, nordsiden af Borneo samt Australien. I kombination med DNA-analyserne gennemgås de indsamlede dyrs morfologi, således at den morfologiske, geografiske variation kan beskrives og sammenlignes med de allerede gennemgåede dyr fra Asien og Australien. I samlingerne på Zoologisk Museum, Københavns Universitet, findes der allerede gode samlinger af giftsnoge fra Asien og Afrika inklusive vævsprøver.



Hvordan kan vi indsamle havslanger på Galathea 3 ekspeditionen: Som allerede nævnt lever havslanger på lavt vand (under 100 m) langs kysterne og op i floderne. Typisk vil man få havslanger med som bifangst ved trawling på lavt vand. Desuden kan havslanger tiltrækkes ved at have en kraftig projektør ud over rælingen om natten (kræver at man ligger for anker eller lignende), hvorefter slangerne kan fanges ved hjælp af et sænke-net eller en ketsjer (optimalt med en platform tæt ved havoverfladen). Denne metode blev blandt andet brugt ud for Trankebar under Galathea II ekspeditionen, hvor man på en enkelt nat samlede over 40 havslanger. En mere aktiv indsamling af havslanger om natten kan foregå ved hjælp af en hurtiggående gummibåd, en kraftig projektør og en ketsjer. Her spottes havslangerne på overfladen ved hjælp af projektøren, hvorefter man indfanger dem med ketsjer, idet båden passerer forbi i god fart. Desuden kan havslanger indfanges med lærredsposer under snorkling eller scuba dykning både dag og nat. Denne metode bruges dog kun i klart vand (bl.a. koralrev) og kræver lidt teknik. Metoden er til gengæld meget nænsom mod slangerne. Jeg har selv prøvet alle ovennævnte metoder til fangst af havslanger.



Havslangeforskningens relevant for udviklingslandene og samarbejdspartnere: Vi ved, at det eneste, som virker 100% effektivt mod slangebid, er monovalent serum. Vi ved, at folk bliver bidt af havslanger (specielt E. schistosa) i Asien hvert år med dødelig udgang (Warrell 1994). Ved at opbygge viden om havslangernes arts- og populationssammensætning vil vi inden for overskuelig fremtid kunne fremstille effektiv serum mod deres bid. En sådan serum vil kunne redde menneskeliv langs kyster og i flodmundinger i hele regionen. Havslangeforskningen er samtidig med til at styrke samarbejdet på tværs af landegrænserne i regionen. Fra regional FAO's side ønskes en styrkelse af kommerciel udnyttelse af havslanger, hvilket vil resultere i, at flere folk kommer i berøring med havslanger med flere bid fra havslanger til følge. Igennem de sidste 15 år er der opbygget et nært samarbejde med lokale institutioner og personer i Asien. Og såfremt det lykkes at deltage i ekspeditionen vil dette netværk danne ramme for de nævnte indsamlinger.



Populærvidenskabelig formidling: Slanger gør sig godt i medier, men det bedste ved at få en formidlingsplatform gennem Galathea 3 ville være at kunne aflive de mange myter, som omgiver både giftige og ugiftige slanger. Gennem de mange populærvidenskabelige foredrag, som jeg har holdt gennem de sidste 15 år, har det gang på gang slået mig, hvor begrænset den almene viden om slanger er, og det til trods for at slanger i forskningsverdenen er en af de mest tværfagelige discipliner, man kan finde (Rasmussen & Nielsen, 1998). Personligt vil jeg finde det meget stimulerende at kunne komme ud til et bredere publikum med min forskning ved at deltage i Galathea 3 ekspeditionen. Gennem de sidste 10 år har jeg undervist medicinere i tropiske giftige dyr med specielt henblik på førstehjælp i kritiske situationer.

Populærvidenskabelig formidling: Slanger gør sig godt i medier, men det bedste ved at få en formidlingsplatform gennem Galathea 3 ville være at kunne aflive de mange myter, som omgiver både giftige og ugiftige slanger. Gennem de mange populærvidenskabelige foredrag, som jeg har holdt gennem de sidste 15 år, har det gang på gang slået mig, hvor begrænset den almene viden om slanger er, og det til trods for at slanger i forskningsverdenen er en af de mest tværfagelige discipliner, man kan finde (Rasmussen & Nielsen, 1998). Personligt vil jeg finde det meget stimulerende at kunne komme ud til et bredere publikum med min forskning ved at deltage i Galathea 3 ekspeditionen. Gennem de sidste 10 år har jeg undervist medicinere i tropiske giftige dyr med specielt henblik på førstehjælp i kritiske situationer.



Konservering af de indsamlede organismer: Udover det daglige arbejde med indsamling af havslanger og registrering af information, vil der blive udført et sideløbende forskningsprojekt ombord for at undersøge og afklare konserveringstekniske problemer. Dette projekt vil som formål have at finde et konserverings-/fikseringsmiddel, der kan erstatte formaldehyd. Projektet vil også have til formål at udvikle og forfine dedikerede konserveringsmetoder til specifikke dyregrupper.

Formaldehyd har været anvendt siden 1893, da Ferdinand Blum opdagede dets egenskaber til at fiksere væv (Blum 1993). Formaldehyd fikserer og bevarer organisk væv ved at danne "krydsbindinger", der fastholder vævets fysiske mikrostruktur. Desværre er disse kemiske bindinger tilsyneladende ikke reversible, og formaldehyd-fikserede præparater kan ikke med den viden, vi har nu, bruges til alle typer forskning.

Formaldehyd ønskes også erstatttet af helbredsmæssige årsager, da det både er særdeles ubehageligt og farligt at arbejde med. Desuden ønskes formaldehyd erstattet på grund af dets negative effekt på PCR af DNA (Carter 202, Srinivesan et al. 2002, Bucklin og Allen 2003, Vincek et al. 2003, Linville et al. 2004) og andre undersøgelser (Benedito-Cecilio og Morimoto 2002, Hendrickx et. al. 2003, Thibault-Botha og Bowen 2004). Som nævnt vil formaldehyd i vådpræparater også blive omdannet til myresyre, der nedbryder præparaterne. De fleste metoder og alternativer til formaldehyd er dog lidet efterprøvede og kan kun afprøves på friske eksemplarer. Det vil derfor være oplagt at udføre forsøget ombord på Galathea 3 ekspeditionen, da der her vil være adgang til tilstrækkelige mængder helt friske organismer.